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反相色谱柱的清洗和再生方法

Date: 2018-11-08 9:19:31 * 浏览: 911

反相色谱柱的清洗和再生方法


    反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用*广泛的技术,主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相本质上都是疏水物质,因此,分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小程度来分离的,样品基体中其它疏水杂质组分也能以同样的方式保留。
除C18、C8、C4、C2、C1、CN、NH2和Phenyl等常见的一些键合硅胶固定相外,还有几个分支品种,如混合相固定相(例如苯基-己基)、封尾和未封尾的填料种类以及极性嵌入固定相等。还有其它很多填料也用于反相色谱,包括聚合物、聚合物包覆硅胶和聚合物包覆氧化铝、无机-有机杂化物、涂覆氧化锆和石墨化碳等。不同的固定相分别都有自己的优点和缺点。
反相色谱柱通过调节流动相组成的变化和添加一些试剂的方式,成功实现了许许多多不同的色谱应用。一些技术是利用添加剂改变了填料的表面特性,有时候这些添加剂本身有可能会污染硅胶和键合相表面。
硅 胶表面除了有疏水键合相外,还有别的一些化学特性。残留的硅醇基存在于所有的硅胶键合填料中。这些硅醇基具有弱酸性,因此能与某些待分析物和样品基体中的杂质相互作用,特别是与碱性物质发生作用。因为硅醇基的pKa值大约是4.5,离子化能在中性pH条件下发生,而存在与阳离子产生静电相互作用的可能。较老的A型硅胶含有高浓度金属杂质离子(有时候达100ppm或更多),而这能使硅胶表面的酸性更大,甚至能与某些金属鳌合化合物发生作用。残留硅醇基在非末封尾的键合硅胶表面和在C2或C4等短链硅胶键合相填料中,麻烦更大。
必须清楚地了解所用固定相的表面特性和可能存在的分析物-固定相表面的相互作用模式,这样当用反相色谱方法时才能充分考虑到潜在的样品基质污染的影响。例如, 疏水性非常强的样品基质如玉米油、高芳香物质和蜡能粘在反相填料的表面并且改变表面性质。含有类蛋白质物质的生物质样品也能吸附在填料表面。尽管分析者想尽努力来保护HPLC柱子免受外源物质的污染,但某些分析物-样品基体的结合作用*终会使固定相受到污染。
当柱子被污染,它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的反相色谱柱会产生反压问题,必须进行清洗和再生才能恢复到原来或接近原来的状态,本文将提出了一些切实可行的恢复方案供大家讨论或参考。着重点在*常用的键合硅胶柱上,其它类型的反相柱的清洁和再生步骤*后也有介绍。

什么原因导致污染物在反相柱上的聚集?

    通常,样品基体中会含有一些对分析者来说不感兴趣的东西,如盐、脂类、含脂物质、腐殖酸、疏水蛋白质和其它一些生物质,是一些可能与HPLC柱发生相互作用的物质。这些物质和目标分析物比,保留能力有些强,有些弱。那些保留能力小的杂质,如盐类,通常在死体积处就会被洗脱出来,在谱图上表现为干扰峰、小斑点、基线扰动、甚至是倒峰等等。而样品基体中的强保留物质,如果流动相的洗脱能力从来没有调高到足以把它们洗脱出来,多次上样后,它们就会在柱头累积。这种现象通常在等度洗脱时容易观察到。保留能力中等的杂质能被缓慢洗出而且表现为 宽峰、基线扰动或者基线漂移。
    有时,这些被吸附的杂质累积到杂质本身足以作为一种新固定相的程度。分析物能与这些杂质作用,起一定的分离作用。此时保留时间会发生漂移,并出现峰形拖尾。如果污染程度再严重下去,柱子的反压能超过泵所能承受的压力,依照发生堵塞的位置不同,可使柱子无法工作或使柱头塌陷产生空洞。

硅胶基质键合反相柱的清洗

    再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的,利用简单的清洗步骤来除去这些污染物往往就能恢复其色谱性能。

    经过等度运行后的色谱柱,有时用90~100%含量的溶剂B(双溶剂反相系统中洗脱能力较强的溶剂,如甲醇、乙晴、四氢 呋喃等)冲洗20个柱体积可以清除污染物(色谱柱的柱体积和空柱管体积概念不同,一根4.6x250mm柱子的柱体积只有2.5ml,4.6x150mm是1.5ml,2.1x150mm是0.28ml,4.6x50mm是0.5ml,3.0x150mm是0.64ml)。

    如果使用的是缓冲盐系统,不要直接切换到强溶剂,突然转换到高浓度有机溶剂可能