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高效液相色谱仪定性定量分析和提纯精制的通用规则

Date: 2020-09-28 13:21:00 * 浏览: 102

1、范围

本标准规定了使用高效液相色谱仪进行的定性定量分析和提纯精制的通用规则 。

本标准适用于使用高效液相色谱仪对无机 、有机化合物的定性定量分析及提纯精制 ,以 及对高分子化合物的分子量的测定的一般要求 。

2、规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本准 的条款。凡是注日期的引用文件 、其随后所有的修改单 (不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准 ,然而 ,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。

3、术语和定义

3.1、高效液相色谱仪:进行高效液相色谱分析的仪器 。

3.2、分析物:样品或样品溶液中存在的待分析的目标组分。

3.3、样品溶液:样品溶解在其中的溶液或提取用于分析的溶液。

3.4、试样溶液:用于测试的样品溶液本身或预处理过的样品溶液。

3.5、泵:驱动流动相 (洗脱剂)的设备 。

3.6、自动进样器:自动将试样溶液接连地注射进到液相色谱仪的柱子中的设备。

3.7、柱温箱:色谱柱置于其中的容器 。

3.8、色谱柱管:柱填料被填充在其中的圆形柱管、其两端装配有过滤器等部件。

3.9、对称因子:表征色谱峰的对称程度的因子。

3.10、柱前衍生化:样品组分在进到色谱柱之前,与衍生试剂反应进行衍生化的过程。

3.11、柱后衍生化:样品组分在色谱柱分离之后,加衍生试剂到洗出液中进行衍生化的过程。

3.12、标准溶液:其特征值如浓度或分子量是已知的并确定足以用作液相色谱分析的标样的溶液。

3.13、分离模式:主要由液相色谱分离机理进行分类的操作模式。

3.14、稀释标准溶液:被稀释成一定浓度的标准溶液。

3.15、混合标准溶液:通过混合一种以上标准溶液或稀释标准溶液制备的含规定浓度样品组分的溶液 。

3.16、内标物:内标法中用作标样的物质。

3.17、分子量分布:与分子量有多分散性的化合物有关。表示了各种分子作为分子量函数的量 。

3.18、分级:通过色谱柱分离和洗脱取得分析物的操作。

3.19、流分:通过分级操作分离得到的溶液。

3.20、方法确认:证明使用高效液相色谱仪的分析方法适合分析目的的各种测试。

4、高效液相色谱仪概述

4.1、液相色谱法(LC)是一种具有下述特征的物理和化学分离分析方法。它使用液体作为流动相,每种分析物在色谱柱的固定相和流动相问的相互作用存在差别,这种差别被利用来分离混合物 。流动相被加压传送以取得短时问内的高效分离的液相色谱分析方法被称为高效液相色谱法(H PLC)。 用于高效液相色谱法的设各被称为高效液相色谱仪。

4.2、LC可应用于测定非挥发性或者热不稳定性化合物,这些化合物难于用气相色谱法测定。囚为LC的扩散速度比气相色谱法慢 ,所以其分离能力比气相色谱法差 。虽然 LC的分离能力没有气相色谱法高 ,但是它具有优良的定量能力和容易得到分离的化合物的流分的特点 。LC不仅可应用于一般有机化合物 ,而且也可应用于离子化合物、天然产物 、聚合物以及其他广泛领域 。

4.3、通过综合分析高效液相色谱法所使用的固定相和流动相,可以认识其各种分离机理 。表1列 出了高效液相色谱法的分类及其分离机理的特点 、典型柱填料及其用途。


4.4、高效液相色谱仪的基本配置如图所示 。HPLC由下列部件组成:流动相提供单元(液体泵)、进样器 、色谱柱和柱箱 、检测器 、数据处理机和记录仪,流动相的流速由泵设定 , 一定体积的流动相被传送到进样器 ,再到色谱柱。泵输送流动相的流速范围通常在 0.01mL/min~10mL/min,常用往复式柱塞泵,当使用梯度洗脱法时 ,使用 1-4个单元泵或者一个梯度器。


4.5、通常用微量注射器量取一定体积的样品溶液 ,注入进样阀,扳动阀钮将样品溶液注入色谱柱。有时使用自动进样器按序列自动进多个样品。

4.6、高效液相色谱仪使用的柱填料其有相对均匀的颗粒尺寸,粒径一般在1um~20um之间,填料被装填在内径1mm~12mm的不锈钢或塑料的色谱柱管屮,柱长一般几十厘米或者更短,填料的粒径和柱子的尺寸根据其用途而有所不同。

4.7、分析物被色谱柱分离,然后基于其物理 、光学 、电 、化学及其他特性被检测器检测 ,高效液相色谱仪的典型检测器是紫外可见光检测器。通常这种检测器的流通池体积在4uL~20uL之间,它测量被分离后的分析物在一定波长下的吸光度(吸收强度 )。 其他检测器包括示差折光指数检测器 、荧光检测器 、电化学检测器 、电导检测器 、质谱仪等 。高效液相色谱仪使用的典型检测器的特点列于表2。当需要选择性检测或 g/L量级以下的高灵敏度检测时,依赖于分析物特征使用不同的检测器。


4.8、如果分析物不能直接检测或者高灵敏检测不可能实现 ,则可使用柱前衍生化或柱后衍生化,前者是分析物在进到色谱柱之前进行的衍生化 ,而后者是分析物被色谱柱分离之后衍生试剂同洗脱液进行混合进行的衍生化。

4.9、检测器得到每个分折物的响应并转化成电信号 ,然后送到数据处理机,记录检测器得到的信号对时间作图得到如图3所示的色谱图,数据处理机基于得到的色谱图进行各种参数运算 ,对分析物进行定性定量分析。当使用保留值对分析物进行定性时 ,用其保留值 (保留时问等)同相同条件下的标准样品的保留值进行比较 ,当使用质谱或二极管阵列检测器对分析物进行定性时 ,用分析物的谱图同标样的谱图进行比较。当进行定量分析时 ,从色谱图得到峰面积值或峰高值 ,将其代入含分析物的标准溶液制得的标准曲线迸行定量测定 。


4.10、另一方面 ,也有可能通过收集与色谱图上色谱峰相对应的流出液对分离的分析物进行等分收集 ,进行提纯 ,即制备型液相色谱法。

5、水 、试剂和溶剂

5.1、水:本标准使用的水应是通过蒸馏或离了交换等方法精制的水 ,或者通过反渗透 、蒸馏 、离子交换等方法结合精制的水 ,水质不应干扰分析 。

5.2、试剂:试剂应是分析纯试剂或质量更好的试剂,试剂不应干扰分析。

5.3、溶剂:溶剂应足高效液相色谱仪级的产品或质量相当或更好的产品。它们不应干扰所使用的检测器的性能。

6、取样及预处理的操作

高效液相色谱仪分析要求按样品的分析目的选择合适的取样方法。根据样品形式和分析目的,样品可直接进高效液相色谱仪 ,或者对分析物进行萃取 、衍生 、浓缩等预处理。

6.1、取样:取样应根据分析目的、样品性质及测试项目使用最佳方法进行 ,考虑具有样品代表性及能区分每个样品特征的差异。如果有专项标准 ,则按该标准迸行取样操作。为了防止由于老化之类的外部因素引起的变化 ,预处理和进样的过程应尽可能快地进行 。如果样品需要贮存 ,耍预先确认样品不会囚为贮存和转移运输发生变化 ,如果在初步试验和实际测定时样品量和分析物浓度存在较大差别 ,则设定的条件将无效 。如果怀疑样品发生了变化 ,则要采取相应对策。用于取样和样品贮存的容器和器具不应含有任何吸附样品或溶解于样品的物质 。贮存容器应贴上必要的警示标签。如果为了保证数据的可靠性需要迸行重复测定 ,则相同样品必须同时在两处或两处以上的 取样点抽取 。

6.2、预处理:

样品在进高效液相色谱仪之前 ,应针对分析目的 、样品性质和测试项目使用最合适的方法进行预处理。预处理一般可改善特性 、精密度 、灵敏度等,消除测量的干扰物质 ,保护色谱柱和仪器免予损坏 ,简化测定操作过程 ,以及使分析物保持稳定 。

预处理包括下列过程 :称重 、蛋白质脱除、 萃取 (液液萃取 、固相萃取 、溶剂蒸馏 、超滤分离、超临界流体萃取等)、净化 (液液萃取 、固相萃取等 )、 脱水 、脱盐 、浓缩 、定容 、 衍生 、标准物加入 、溶剂调整(衍生化 、溶解在适于进样的溶剂中)等等。如果有专项标准,则按该标准进行预处理 ,如果加入内标物 ,在色谱图上内标物应与样品基质很好地分离。其保留时间应与目标组分的保留时间差别不大。如果使用质谱 ,与内标物的分离不一定是必需的。样品应溶解在少量其淋洗能力等于或小于流动相的溶剂中。溶剂可能影响稳定性和目标组分的分离 ,因此应谨慎选择 。必要时 ,使用0.2um~0.5um的过滤膜对样品进行过滤以除去不溶物 。预处理有可能引起来 自试剂 、容器 、环境等的污染 ,引起杂质的混入以及分析物的损失 ,应引起注意。

7、仪器配置

7.1、流动相供应单元:输送流动相(洗脱剂)到色谱柱的供应单元 ,主要由下列部件组成 :

7.1.1、洗脱剂储液器:洗脱剂储液器应使用不影响流动相 (洗脱剂 )化学组成的材料制成 ,洗脱剂储液器应防止在使用过程中环境囚素对流动相的污染 ,如蒸发变质等。

7.1.2、脱气器:脱气器被用来连续脱除溶剂在流动相(洗脱剂)中的空气 ,以免由于仪器内温度压力变化引起的气泡问题 ,从而保证稳定的流速和信号背景。

7.1.3、供液泵:以精确流速将流动相(洗脱剂)输送到色谱柱的泵必须满足下列要求 :

a) 流速范围宽 ;

b) 流速精度高;

c) 流量脉动低 ;

d) 在较宽的压力范围内具有稳定的输液能力;

c) 与液体接触的材料具有优异的化学隋性 ,

f) 易于更换流动相 。

7.1.4、梯度洗脱单元:梯度洗脱单元由控制器和混合器组成 ,控制器可以连续改变混合流动相(洗 脱剂 )的组成而混合器将获得均匀的混合溶液。混合比的设定范围要宽 ,浓度要精确。

7.2、进样器:进样器的材料和构造应确保所进的样品没有吸附保留,进样重复性好。如果用自动进样器自动进行许多试样的进样 ,那么它应具有以下基本功能 :重复性、定量进样准确性、保留小 、极小的样品量等等。如果有预期的用途需要 ,则应加上冷却功能 ,以便增加制备好的样品数量和 降低样品组分的分解和蒸发 。

具有样品预处理功能或柱前衍生化功能的自动进样器也可能用到。

7.3、分离单元

7.3.1、色谱柱