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液相色谱仪的原理和应用

Date: 2020-08-28 9:05:38 * 浏览: 233

液相色谱以液体作为流动相的色谱分离方法。适用于高沸点,大分子,强极性和热稳定性差的化合物分析。流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用。液相色谱仪是指利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异,对混合物进行先分离,而后分析鉴定的仪器。本文简单介绍了液相色谱仪的工作原理及应用。

液相色谱法是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物(包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物)的有效方法之一。在已知的有机化合物中,约有80%能用高效液相色谱法分离、分析,而且由于此法条件温和,不破坏样品,因此特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。

液相色谱仪系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等,现代液相色谱仪还有微机控制系统,进行自动化仪器控制和数据处理。

由于液相色谱仪具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。


一、液相色谱仪工作环境

避免强烈振动;

避免阳光直射;

湿度小于等于80%;

温度在5-40度之间;

避免强大的电场或磁场;

仪器表面不防水,若有水溅上,应立即擦去。


二、液相色谱仪的工作原理

液相色谱系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。简易流程图如下:

液相色谱仪的原理和应用.png

1、溶剂(1)溶剂的选择

流动相的选择:

采用“HPLC色谱”级溶剂;避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂;对试样有适宜的溶解度;溶剂粘度小;与检测器匹配。

缓冲液的使用:

尽可能使用高级别纯度的化学试剂配制;避免使用前必须过滤;使用后一定要进行清洗,以免造成腐蚀,磨损,阻塞;用纯水冲洗30min-60min(1ml/min),再用甲醇冲洗30min;易受到细菌和霉菌的影响。

(2)溶剂的处理

过滤:0.45um或更小孔径滤膜,目的是除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱尤其是使用无机盐配制的缓冲盐。

脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。

泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积;柱中气泡使流动相绕流,使峰变形;检测器中的气泡会产生基线波动。

2、柱塞泵

柱塞泵包括串联式柱塞往复泵和并联式微体积柱塞往复泵。


3、进样器

进样器包括自动进样器和手动进样器,手动进样器的注入方式分为全量注入和部分注入。


部分注入:一般要求进样量Z多为定量环体积的一半,如20ul的定量环,Z多进样10ul的样品,并且要求每次进样体积准确、相同。


全量注入:进样量Z少为定量环体积的3至5倍,即20ul的定量环Z少进样60至100ul的样品,这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液,达到所要求的精密度及重现性。


4、柱温箱

使用柱温箱,可使分析结果重现性好;提高柱效;降低柱压;保证检测稳定性。


5、检测器

原理是:基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收。

其优点:灵敏度高;对温度和流速不敏感;可用于梯度洗脱。

缺点:仅适用于测定有紫外吸收的物质。

常用的检测器类型:紫外检测器(包括二极管阵列检测器)、荧光检测器、示差折光检测器、电导检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器。


三、液相色谱仪应用

液相色谱法只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。

与试样预处理技术相配合,液相色谱仪所达到的高分辨率和高灵敏度,使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展,有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离HPLC成为解决生化分析问题Z有前途的方法。

由于液相色谱仪具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。

液相色谱仪的原理和技术受到普遍重视,如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等;液相色谱-红外光谱连用也发展很快如在环境污染分析测定水中的烃类,海水中的不挥发烃类,使环境污染分析得到新的发展和应用。