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高效液相色谱法监测环孢素A的全血浓度

Date: 2018-12-26 10:51:02 * 浏览: 218

【摘要】  目的:建立高效液相色谱法测定环孢素A全血浓度的方法。方法:采用Spherisorb C 8(150 mm×4.6 mm,5 μm)分析柱,流动相为甲醇∶水(75∶25,V/V),检测波长214 nm,流速1 ml/min,柱温为60 ℃。结果:环孢素A浓度在50 ng/ml~2 000 ng/ml范围内线性良好(r=0.999 8),平均方法回收率为99.7%,日内及日间精密度<6% (n=5)。结论:本方法简便、准确、可靠,能较好的满足临床血药浓度监测的需要。

【关键词】  环孢素A;高效液相色谱法;血药浓度监测


  Hplc Determination of Cyclosporin A in Whole Blood

  Abstract:Objective To establish a HPLC method for the determination of cyclosporin A in whole blood.Methods The Spherisorb C 8 column(150 mm×4.6 mm,5 μm)was used,the mobile phase was methanol?water(75:25, V/V),the detection wavelength was at 214 nm,the flow rate was 1 ml/min and column temperature was 60 ℃.Results The linear range of cyclosporin A was 50 ng/ml~2 000 ng/ml(r=0.999 8). The average recovery was 99.7%(n=5). Within?day and between?day variation co?efficients were less than 6%.Conclusion The method is simple, accurate,and reliable.It is suitable for therapeutic drug monitoring.

  Key words:Cyclosporin A;HPLC;Therapeutic durg monitoring

  环孢素A(Cyclosporin A,CsA)是一种强效的免疫抑制剂,目前广泛应用于器官移植术后的抗排异反应。环孢素A治疗窗窄,个体差异大,用药时间长,保持适宜的血药浓度至关重要。CsA的血药浓度过高易引起肝、肾及中枢神经系统损害和感染;过低则发生排斥反应和诱发自身免疫性疾病,其肾毒性反应与肾移植术后发生的排异反应难以区别[1]。因此为提高CsA用药的安全性和有效性,必须在其治疗过程中定期监测血药浓度,并调整给药剂量[2]。我们用高效液相色谱法对器官移植患者术后CsA的全血浓度进行监测,并参考文献,对全血处理方法进行了研究和改进,使其能较好地满足临床的需要。

  1  材料与方法

  1.1  仪器与试剂  美国Waters系列高效液相色谱仪(包括1525二元泵、2487紫外检测器、柱温箱、Breeze色谱工作站);FA2004型电子天平(上海天平仪器厂);L?128B型试管氮吹浓缩仪、L?119型试管恒温加热仪(北京来亨科贸有限责任公司技术开发中心) ;YKH?Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂) ;LG10?2.4A型离心机(北京医用离心机厂) 。CsA标准品由中国药品生物制品检定所提供,批号:130495?200202,含量98.8%;CsD对照品由华北制药集团提供,含量99.5%;甲醇为色谱纯、钨酸钠、乙醚、正己烷均为分析纯。CsA贮备液:精密称取CsA标准品20 mg,加甲醇溶解并定容至100 ml,得200 μg/ml的 CsA储备液。CsA标准液:精密量取CsA贮备液5 ml,分别用甲醇稀释至50 ml和200 ml,得20 μg/ml和5 μg/ml的CsA标准液。内标工作液:精密称取CsD 36 mg,加甲醇溶解并定容至100 ml,从中精密量取10 ml,加甲醇稀释至100 ml,得36 μg/ml的内标工作液。上述溶液均置4 ℃冰箱保存。

  1.2  色谱条件  色谱柱为Spherisorb C8柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),大连依利特分析仪器有限公司提供;流动相为甲醇∶水(75∶25,V/V);流速1 ml/min;检测波长214 nm;柱温60 ℃;灵敏度:0.100 0AUFS。

  1.3  血样处理方法  取全血0.5 ml,精密加入内标工作液10 μl,涡旋30 s;加0.1 mol/L NaOH溶液(内含2%钨酸钠)1 ml,涡旋30 s;加重蒸乙醚5 ml,涡旋提取2 min,4 000 r/min离心10 min;分离乙醚层,于40 ℃试管恒温加热仪上氮气吹干,残渣加甲醇-10 mmol/L盐酸(3:1)溶液80 μl溶解,涡旋30 s;加正己烷300 μl, 涡旋30 s,3 000 r/min离心10 min,取下清液10 μl进样。

  2  结果

  2.1  色谱行为  在上述色谱条件下,色谱分离情况见图2,CsA、CsD保留时间分别为9.0 min 和10.8 min。可见CsA和CsD色谱峰分离完全,峰形良好,全血中内源性物质不干扰CsA的测定。

  图1  空白血样(略)

  图2  样品血样  1 CsA  2 CsD(略)

  2.2  线性关系及检测限  取空白全血0.5 ml,分别加入内标工作液10 μl及CsA标准液适量,使CsA浓度分别为50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ ml、400 ng/ ml、800 ng/ ml、1 200 ng/ml、1 600 ng/ml、2 000 ng/ml,按“1.3