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反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物

Date: 2018-12-24 13:52:02 * 浏览: 270

Reversedphase high performance liquid chromatography assay for determining 4 kinds of markers of diabetic nephropathy in urine

  【Abstract】 AIM: To establish a new reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method for assay 4 kinds of nonproteinnitrogen markers of human diabetic nephropathy (DN),  creatine (Cr), creatinine (Cn), urea (U) and uric acid (Ua) in DN patients urines. METHODS: The urine samples were assayed by RPHPLC on C18 column (200 mm×4.6 mm, id 5 μm) at the ambient temperature and a wave length of 200 nm, using a 10 mmol/L pH 6.86 phosphate buffer [consisted 30%(V/V) methanol] as mobile phase with the flow rate of 0.9 mL/min. RESULTS: Baseline separation of the urine could be easily achieved in 5 min after a simple sample preparation. The method also displayed a high reproducibility (RSD values of retention time and peak area were no more than 3%) and the calibration curves showed good linearities in the range of 5-300 μmol/L, 10-200 μmol/L, 1-30 μmol/L, 10-1500 μmol/L for Cr, Cn, U and Ua respectively. CONCLUSION: This method has great potential for routine assay of clinical urine samples and monitoring DN early.

  【Keywords】 reversed high performance liquid chromatography; diabetic nephropathy; nonprotein nitrogen; urine

  【摘要】 目的:建立糖尿病患者尿液中与肾病相关的非蛋白氮代谢产物(肌酸、肌酐、尿素和尿酸)的反相高效液相色谱分离分析方法. 方法:采用Agilent C18(200 mm×4.6 mm, 内径5 μm)色谱柱,流动相含30%(体积比)甲醇和10 mmol/L,pH 6.86的磷酸缓冲溶液,流速0.9 mL/min,检测波长200 nm,柱温为室温. 结果:在5 min内可对患者尿液中上述4种物质同时进行测定,样品前处理简单,重现性较好(迁移时间和峰面积的RSD均≤3%),线性范围较宽(肌酸:5~300 μmol/L, 肌酐:10~200 μmol/L, 尿素:1~30 mmol/L, 尿酸:10~1500 μmol/L). 结论:此法完全适用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.

  【关键词】 反相高效液相色谱;糖尿病肾病;非蛋白氮;尿样

  0引言

  糖尿病并发肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者致死的重要原因之一,已引起了人们的广泛关注. 非蛋白氮代谢产物如肌酸(creatine, Cr)、肌酐(creatinine, Cn)、尿素(urea, U)和尿酸(uric acid, Ua)即是与DN相关的几种物质. 已报道的有关这些物质的分离分析方法主要有比色法[1]、酶法[2]、液相色谱法[3-6]、毛细管电泳法[7-9]等. 其中比色法和酶法通常只能测定单一的物质,而且尿液中的一些内源性物质对测定有干扰;液相色谱法则多集中在对某一种或部分物质的测定上;毛细管电泳测定这些标志物重现性有待于提高. 我们运用反相高效液相色谱法,对DN患者尿液中与DN相关的Cr, Cn, U和Ua这4种非蛋白氮代谢产物进行同时分离检测. 同时测定尿液中的4种物质目前还未见报道. 此法具有快速、灵敏度高和重现性好的特点,完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.

  1材料和方法

  1.1材料Agilent 1100液相色谱仪(美国Agilent公司);Cr,Cn,Ua均购自Sigma公司(USA,Sigma);甲醇为色谱纯试剂(天津第二化学试剂厂);其余试剂均为分析纯,水为二次重蒸水.

  1.2方法

  1.2.1色谱条件色谱柱为Agilent C18柱(200 mm×4.6 mm,内径5 μm),流动相含体积比为30%的甲醇和10 mmol/L,pH 6.86的磷酸缓冲溶液,等度洗脱,流速0.9 mL/min,检测波长200 nm,柱温为室温,进样量为10 μL.

  1.2.2标准溶液的配置和尿样的处理方法Cr, Cn和U标准溶液均使用二次重蒸水配置成一定的浓度. Ua溶液的配置方法如下:取30 mg磷酸钾,溶解在40 mL重蒸水中,加热至60℃,使其完全溶解,精确称取Ua 28 mg,溶解于热磷酸钾溶液中,冷却至室温,移入100 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,贮存在棕色瓶中保存. 尿液样品的处理方法:取新鲜的尿液用水稀释1倍后待用. 所有溶液每周更换1次,使用前均过0.45 μm的水相膜后再用于色谱分析.

  2结果

  2.1色谱条件的优化固定其它色谱条件不变,分别改变缓冲液的pH值、流动相(pH 6.86)中甲醇比例、流动相中缓冲液浓度和流动相的流速,考察了其对4种物质分离的影响. 四种物质的分离随pH、甲醇比例、磷酸缓冲液浓度和流动相的流速的变化情况分别如图1,2所示.