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分离肽和蛋白质色谱柱的维护

Date: 2018-11-16 11:23:26 * 浏览: 404

1、使用常规要求

      pH:为了保证色谱柱长寿命,硅胶基质色谱柱的使用pH范围是2~7,超出此范围的色谱柱寿命与功能团结构有关,但是偏离2~7范围越远,色谱柱性能下降的越快。

     温度:典型硅胶基质色谱柱的使用温度在5℃与60℃之间,高温使用会缩短柱寿命。

     缓冲溶液:生物样品分离通常要求使用缓冲溶液控制流动相的pH值,仔细控制避免缓冲溶液与流动相有机溶剂混合时产生沉淀,色谱柱和HPLC系统不能储存在含盐或缓冲溶液的体系中。

     压力:操作压力升高,色谱柱寿命缩短,通常要求色谱柱使用中压力低于3000psi。压力与流动相流速和柱长成正比,与粒径平方成反比。相同规格的3μm填料色谱柱压力约为5μm色谱柱的两倍。流动相不同压力也会有明显差异,如60/40的甲醇/水大约是60/40甲醇/水的两倍。随色谱柱使用,压力会缓慢增加,色谱柱压力突然增加可能是色谱柱或连接管堵塞。

2、色谱柱的维护

    使用在线过滤器和保护柱能够有效避免微粒和杂质在色谱柱头的聚集,增加色谱柱寿命,  在进样阀和色谱柱之间依次安装在线过滤器和保护柱的效果最好。

     过滤:进样阀和色谱柱之间的在线过滤器能够有效阻止来自流动相、泵密封圈和样品的微粒。在线过滤器筛板的孔径小于色谱柱入口筛板孔径时效果最好。在线过滤器常用孔径为0.5μm,系统压力升高时需要更换在线过滤器。

     保护柱:保护柱实际上通常是比较短的分析柱,通过吸附可能污染分析柱的强保留杂质达保护色谱柱的目的。保护柱的筛板与在线过滤器一样可以阻挡微粒杂质。为了达到最好的保护效果同时避免导致色谱的改变,最好选用与分析柱相同或相似的填料填充保护柱(如C18分析柱用C18保护柱)。保护柱不要选用保留太强的填料,以免使保留整体增加。为了降低保护柱对分离的贡献,可以用比分析柱填料保留弱的填料填充,如用150? C18分析柱时,可以选用比表面积较小的300? 大孔C18填充保护柱。分离明显变差或反压明显升高时需要更换保护柱。

3、色谱柱的清洗

     如果样品中部分组分没有被流动相洗脱,它们就会逐渐在色谱柱中聚集,最后导致色谱柱性能变差,为了保证色谱柱重复性、延长使用寿命,应该周期性地对色谱柱进行清洗而不能够任其自然。如果色谱柱设计中可以反向使用,反压太高时,用低流速反向冲洗不会对填充良好的硅胶柱床造成损害,反向冲洗时不要接检测器。

     反向冲洗一般使用常用流速的1/2,用强洗脱溶剂冲洗10~20 色谱柱体积。反相色谱一般使用极性有机溶剂如异丙醇含量较高的溶剂冲洗。用几次循环从弱到强的梯度有时比用强洗脱能力流动相等度冲洗效果更好,对疏水性蛋白质吸附的反相色谱柱非常明显。

     如果上述过程清洗色谱柱的效果不够理想, 可以用非极性有机溶剂或低浓度表面活性剂清洗,二氯甲烷或氯仿对强疏水性或油性化合物的效果较好,表面活性剂如0.5%SDS可以有效清除沉淀的蛋白质,改性剂,如5~8M的脲或盐酸胍可以有限去除强吸附蛋白质。另外,用明显高或低于使用流动相pH值的稀缓冲溶液对部分不溶性沉淀有较好的作用。最有效地清洗方法还取决于色谱柱和样品的具体情况。

     上述过程的主要目的是去除在使用流动相条件下不能洗脱的化合物, 另一个目的是对由于流动相或部分化合物引起缓慢变性的色谱柱进行更新。用有机溶剂冲洗色谱柱之前,应该首先用水含量较高的混合溶液(如90/10 H2O/ACN)将缓冲溶液和添加剂置换冲洗,不要用纯水。升高温度能够改进清洗效果。

     色谱柱头的烧结筛板用于固定色谱柱床填料,只有在准备修补色谱柱时才能打开,建议在打开之前与仪器公司技术人员联系。

4、色谱柱的储存

     乙腈和水的混合溶剂是储存反相色谱柱的理想溶剂,其中乙腈含量应不低于10%,避免在TFA等酸性条件下储存色谱柱,缓冲溶液和添加剂应该从系统中冲洗干净,以免由于溶剂挥发造成沉积,理想的储存溶剂应该抑制微生物的生长并不能导致固定相的水解,因此不能在纯水条件下储存色谱柱。储存溶剂最好能够与使用流动相互溶,10%乙腈储存色谱柱可以直接用几乎所有的分析流动相平衡,不会引起盐沉淀。

    虽然没有确切的色谱柱干燥储存对性能影响的证据,但为防止溶剂挥发,不锈钢堵头比塑料堵头更好。用醇/水混合溶剂清洗和储存色谱柱时,注意由于粘度较大,避免导致压力太高。